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    • 专利摘要:
    EinVerfahren und eine Vorrichtung zur Justierung der beiden Objektive(19, 20) in einer 4Pi-Anordnung eines vorzugsweise konfokalen Scanmikroskops(1), wobei mindestens eines der Objektive (19, 20) relativ zu demanderen Objektiv (20, 19) bewegbar ist, ist im Hinblick auf eineeinfache Durchführbarkeitder Justierung sowie im Hinblick auf eine hohe Stabilität der Justierung über einenlangen Zeitraum dadurch gekennzeichnet, dass ein Referenzobjektin den Pupillen der Objektive (19, 20) abgebildet wird, dass ausden Abbildungen des Referenzobjekts für jedes Objektiv (19, 20) eineigenes Fourier-Bild erzeugt wird und dass durch Bewegen zumindest einesder Objektive (19, 20) relativ zu dem anderen die beiden Fourier-Bilderdes Referenzobjekts zur Deckung gebracht werden.
    公开号:DE102004001441A1
    申请号:DE200410001441
    申请日:2004-01-08
    公开日:2005-10-13
    发明作者:Reiner Rygiel
    申请人:Leica Microsystems Heidelberg GmbH；Leica Microsystems CMS GmbH；
    IPC主号:G02B21-00
    专利说明:
    [0001] DieErfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Justierungder beiden Objektive in einer 4Pi-Anordnung eines vorzugsweise konfokalen Scanmikroskops,wobei mindestens eines der Objektive relativ zu dem anderen Objektivbewegbar ist.
    [0002] In4Pi-Anwendungen müssenimmer zwei Objektive, die einander bezüglich einer Fokusebene gegenüber liegenund in orthogonaler Strahlachse zur Fokusebene stehen, derart ausgerichtetwerden, dass sich ihre Fokusse jeweils genau in einem Punkt innerhalbder Fokusebene treffen. Nur bei dieser exakten Positionierung derbeiden Objektive zueinander ist es möglich, qualitativ hochwertigeund fehlerfreie Aufnahmen zu erstellen.
    [0003] Derzeitsind nur sehr wenige Verfahren und Vorrichtungen der eingangs genanntenArt bekannt. Bei den bekannten Verfahren steht eines der beiden Objektive örtlich fest,währenddas andere Objektiv manuell in x-, y- und z-Richtung verschobenwird. x und y bezeichnen dabei konventionellerweise die Ebene orthogonalzur Strahlachse, und die z-Richtung ist in Richtung der Strahlachsedefiniert. Bei den bekannten Verfahren wird ein Strahlengang ausdem 4Pi-Aufbau ausgekoppelt und der interferometrische Aufbau der4Pi-Anordnung genutzt. Im Konkreten wird das interferometrischeBild beobachtet und das bewegbar angeordnete Objektiv in x- und in y-Richtungsolange verschoben, bis sich ein Bild einstellt, das die nullteOrdnung zeigt.
    [0004] Dasbekannte Verfahren ist unter zahlreichen Gesichtspunkten problematisch.So kann zum einen die beschriebene Vorgehensweise nur für eine Justierungder beiden Objektive in x- und y-Richtung angewendet werden, wohingegendie Justierung in z-Richtung ein gänzlich anderes Verfahren erfordert. Für die Praxisbedeutet das, dass ein Benutzer während der Justage zwischenbeiden Verfahren wechseln muss, was für ihn mit einem großen Zeitverlust verbundenist. Zudem ist nachteilig, dass der Zustand, in dem die beiden Objektiveexakt zueinander justiert sind, beispielsweise aufgrund von Driftsoder Vibrationen nicht überlängereZeit stabil bleibt. Das hat zur Folge, dass die Bildaufnahme nurin dem Zeitraum möglichist, in dem die abgeschlossene Justage gerade stabil ist. Bei einerauftretenden Dejustage muss der Messvorgang abgebrochen werden,die beiden Objektive müssenerneut exakt zueinander ausgerichtet werden, und erst dann kanndie Messung fort gesetzt werden. Nicht zuletzt dieser kompliziertenund zeitaufwendigen Justierung, die zudem ein hohes Maß an Kenntnissenund Erfahrung erfordert, ist es zuzuschreiben, dass der 4Pi-Mikroskopie bislangder großeDurchbruch im Hinblick auf eine routinemäßige Anwendung versagt gebliebenist.
    [0005] Dervorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahrenund eine Vorrichtung zur Justierung der beiden Objektive in einer 4Pi-Anordnungder eingangs genannten Art derart auszugestalten und weiterzubilden,dass zum einen eine einfache und ohne spezielle Kenntnisse benutzerseitigdurchführbareJustierung möglichist und dass zum anderen eine Stabilität der 4Pi-Bildaufnahme über einenlangen Zeitraum erreicht ist.
    [0006] Erfindungsgemäß wird dievoranstehende Aufgabe hinsichtlich eines Verfahrens zur Justierung derbeiden Objektive in einer 4Pi-Anorndung durch ein Verfahren mitden Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst. Danach ist ein Verfahrender eingangs genannten Art derart ausgestaltet, dass ein Referenzobjektin den Pupillen der Objektive abgebildet wird, dass aus den Abbildungendes Referenzobjekts fürjedes Objektiv ein eigenes Fourier-Bild erzeugt wird und dass durchBewegen zumindest eines der Objektive relativ zu dem anderen diebeiden Fourier-Bilder des Referenzobjekts zur Deckung gebracht werden.
    [0007] DesWeiteren ist die obige Aufgabe im Hinblick auf eine Vorrichtungzur Justierung der beiden Objektive in einer 4Pi-Anordnung durcheine Vorrichtung mit den Merkmalen des Patentanspruchs 14 gelöst. Danachist eine Vorrichtung der eingangs genannten Art derart ausgestaltet,dass zur Abbildung eines Referenzobjekts in den Pupillen der Objektive eineBeleuchtungseinrichtung und optische Einkoppelmittel vorgesehensind, dass aus den Abbildungen des Referenzobjekts für jedesObjektiv ein eigenes Fourier-Bild erzeugbar ist und dass durch Bewegenzumindest eines der Objektive relativ zu dem anderen die beidenFourier-Bilder des Referenzobjekts zur Deckung bringbar sind.
    [0008] Inerfindungsgemäßer Weiseist zunächsterkannt worden, dass in der 4Pi-Mikroskopieinsbesondere der Vereinfachung der Justierung der Objektive eineganz entscheidende Bedeutung zukommt. Diese Vereinfachung ist erfindungsgemäß dadurchrealisiert, dass ein Referenzobjekt in den Pupillen der Objek tiveabgebildet wird und dass aus den Abbildungen des Referenzobjektsfür jedesObjektiv ein eigenes Fourier-Bild erzeugt wird. Mit dem Fourier-Bildist ein optisch sehr sauberes Instrument geschaffen, mit dem dieexakte Ausrichtung der Objektive zueinander ganz einfach dadurchrealisiert werden kann, dass zumindest eines der Objektive relativzu dem anderen solange bewegt wird, bis sich die beiden aus denbeiden Objektiven stammenden Fourier-Bilder des Referenzobjektseinander genau überdecken. Aufgrundder hohen Sensitivität,die durch Ausnutzung der Fourier-Bildererreicht wird, kann die exakte Ausrichtung der beiden Objektivezueinander zudem übereinen langen Zeitraum beibehalten werden, so dass mit einer sehrlangen stabilen 4Pi-Bildaufnahme zu rechnen ist. Schließlich istgegenüberden bekannten Verfahren und Vorrichtung ein Vorteil dahingehendgeschaffen, dass die Objektive sowohl in der x, y-Ebene als auchin der z-Richtung im Wesentlichen in gleicher Weise justiert werdenkönnen.Das erfindungsgemäße Verfahrenerfordert noch nicht einmal den Ausbau der Probe oder sonstige störende Eingriffein das Mikroskop selbst.
    [0009] Inbesonders vorteilhafter Weise könntedas Referenzobjekt eine zweidimensionale Struktur aufweisen, sodass im Fourier-Bild Beleuchtungsverteilungen sowohl entlang derx-Achse als auch entlang der y-Achse auftreten. Im Hinblick aufeine gute Auswertbarkeit der Fourier-Bilder und insbesondere, um imFourier-Bild entlang der x-Achse und entlang der y-Achse dieselbeBeleuchtungsverteilung zu erhalten, könnte das Referenzobjekt bevorzugtals Kreuzblende ausgeführtsein.
    [0010] ZurVermeidung möglichstjeglichen Eingriffs in den Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang der4Pi-Anordnung ist es von ganz besonderem Vorteil, das Referenzobjektaußerhalbder 4Pi-Anordnung bereitzustellen.
    [0011] AlsBeleuchtungseinrichtung könnteeine Laserlichtquelle vorgesehen sein, wobei es sich hier insbesondereum eine Infrarot-Laserlichtquelle handeln könnte. Es hat sich gezeigt,dass durch infrarotes Beleuchtungslicht die mikroskopische Bildaufnahmenahezu nicht beeinflusst wird.
    [0012] ZurEinkopplung des Lichts der Beleuchtungseinrichtung in den 4Pi-Strahlengangkönnten einStrahlteilerwürfelund eine Linse vorgesehen sein. Durch die Verwendung eines Strahlteilerwürfels, vorzugsweiseeines 50/50-Strahlteilerwürfels, wird zumeinen erreicht, dass das Licht der Beleuchtungseinrichtung problemlosin den 4Pi-Strahlengang einkoppelbar ist, und wird zum anderen erreicht,dass das aus dem 4Pi-Strahlengang wieder austretende Licht nichtvollständigauf das Referenzobjekt bzw. die Beleuchtungseinrichtung zurückgestrahltwird, sondern zur Untersuchung der Fourier-Bilder bereitgestelltwerden kann.
    [0013] Umdas Referenzobjekt in den Pupillen der Objektive abzubilden, istdas Referenzobjekt in vorteilhafter Weise unmittelbar auf der derBeleuchtungseinrichtung zugewandten Seite des Strahlteilerwürfels angeordnet.
    [0014] Ineiner konkreten Ausführungsformist vorgesehen, die Fourier-Bilder mittels einer Linse auf eineKamera, vorzugsweise auf eine CCD-Kamera, abzubilden. Die aus denbeiden Objektiven resultierenden Fourier-Bilder des Referenzobjektserscheinen dabei ähnlichzweier Fadenkreuze im Kamerabild und können daher auf besonders einfacheWeise im Rahmen einer ersten Grobjustierung durch Bewegen mindestenseines der beiden Objektive relativ zu dem anderen Objektiv zur gegenseitigen Überdeckunggebracht werden.
    [0015] Für eine anschließende hochpräzise Feinjustierungkönntedas Überdeckender beiden Fourier-Bilder mittels in der Ebene der Fourier-Bilderplatzierter Photodioden kontrolliert werden. Zur einfachen Unterscheidungzwischen horizontal (d.h. in x-Richtung)und vertikal (d.h. in y-Richtung) verlaufenden Beleuchtungsstrukturenim Fourier-Bild werden die Photodioden in vorteilhafter Weise imRaum höhererOrdnung der Fourier-Bilder angeordnet.
    [0016] Ineiner bevorzugten Ausführungsformsind zwei Photodioden entsprechend der zweidimensionalen Strukturdes Referenzobjekts derart angeordnet, dass die eine Photodiodedie vertikalen Strukturen und die andere Photodiode die horizontalen Strukturender Fourier-Bilder erfasst. Selbstverständlich können auch mehr als zwei Photodiodenvorgesehen sein.
    [0017] ZurPositionierung der Objektive in der x, y-Ebene, wird mindestenseines der Objekte solange verschoben, bis sich an beiden Photodiodenjeweils ein maximaler Intensitätswerteinstellt. In diesem Fall ist garantiert, dass sich die Fourier-Bilderexakt decken und dass sich die Fokusse der beiden Objektive exaktin einem Punkt innerhalb der Fokusebene treffen. Die mit den jeweiligenmaximalen Intensitätswertender beiden Photodioden korrespondierende x, y-Positionierung derObjektive könntezum Zwecke einer späterenAbrufbarkeit in einem Permanentspeicher gespeichert werden.
    [0018] ZurJustierung der Objektive entlang der Strahlachse, d.h. in z-Richtung,könntemindestens eines der Objektive in Richtung der Strahlachse so verschobenwerden, dass das Summensignal der Photodioden einen maximalen Intensitätswert erreicht.Das Summensignal der beiden Photodioden wird nämlich gerade dann maximal,wenn die Fourier-Bilder scharf abgebildet werden, d.h. die Objektivein z-Richtung derart zueinander positioniert sind, dass sich ihreFokusse genau in einem Punkt der Fokusebene treffen. Auch die mitdem Maximum des Summensignals der beiden Photodioden korrespondierendez-Positionierung der Objektive könntein einem Permanentspeicher gespeichert werden.
    [0019] Weichendie Signalintensitätender Photodioden von den Maximalwerten ab, was gleichbedeutend istmit einer beispielsweise durch Drift oder Vibration hervorgerufenenDejustierung der Objektive, so könntevorgesehen sein, dass die Messung automatisch unterbrochen wird.Für denGrad der nicht mehr tolerierbaren Abweichungen, bei denen die Messunggestoppt werden soll, könntenim Vorfeld einer Messung Grenzwerte festlegbar sein. Das Unterbrechender Messung könntedem Benutzer durch ein akustisches und/oder optisches Signal angezeigt werden.
    [0020] Ineiner besonders bevorzugten Ausführungsformist vorgesehen, dass beim Auftreten von Abweichungen der Signalintensitäten derPhotodioden vom Maximalwert das Objektiv automatisch nachgeführt wird.Dazu könntenim Konkreten piezoelektrische Verstellelemente an dem Objektiv vorgesehensein, die in Abhängigkeitder Signalintensitätender Photodioden ansteuerbar sind. Die Ansteuerung der piezoelektrischenVerstellelemente könnte auchin Abhängigkeitvon Auswertedaten einer Bildverarbeitung der Kamerabilder erfolgen.
    [0021] DasKontrollieren der Fourier-Bilder und ggf. das Nachführen desObjektivs könntewährendeiner Messung in regelmäßigen Abständen zyklischwiederholt werden. Dafürkönntedie Messung unterbrochen werden, es ist jedoch ebenfalls denkbar,die Messung weiterlaufen zu lassen. Im zuletzt genannten Fall istes von besonde rem Vorteil, die während einerMessung durchgeführtenBewegungen des Objektivs zu protokollieren. Anhand der protokollierten Datenkönnenggf. Fehler bei der späterenBildauswertung korrigiert werden.
    [0022] Esgibt nun verschiedene Möglichkeiten,die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestaltenund weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch1 nachgeordneten Patentansprücheund andererseits auf die nachfolgende Erläuterung eines bevorzugten Ausführungsbeispielsder Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mitder Erläuterungdes bevorzugten Ausführungsbeispielsder Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugteAusgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. Inder Zeichnung zeigt
    [0023] 1 ineiner schematischen Darstellung eine 4Pi-Anordnung sowie die Ankopplungeiner erfindungsgemäßen Vorrichtungzur Justierung der beiden Objektive der 4Pi-Anordnung und
    [0024] 2 ineiner schematischen Darstellung ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.
    [0025] 1 zeigt – schematisch – eine 4Pi-Anordnungeines konfokalen Scanmikroskops 1 zur Untersuchung einesObjekts 2. Das Scanmikroskop 1 umfasst einen Beleuchtungsstrahlengang 3 einerLaserlichtquelle 4, einen Detektionsstrahlengang 5 eines Detektors 6 undein den Beleuchtungsstrahlengang 3 in zwei Beleuchtungsteilstrahlengänge 7, 8 aufspaltendesund den Detektionsstrahlengang 5 vereinigendes Bauteil 9.
    [0026] Daszur Beleuchtung des Objekts 2 dienende Beleuchtungslicht 10 derLichtquelle 4 wird übereine Linse 11 auf die Anregungslochblende 12 abgebildet. Dasdie Anregungslochblende 12 passierende Licht wird von demdichroitischen Strahlteiler 13 in Richtung einer Strahlablenkvorrichtung 14 reflektiert.Die Strahlablenkvorrichtung 14 scannt den Beleuchtungslichtstrahl 10 inzwei im Wesentlichen senkrecht zueinander stehenden Richtungen.Der von der Strahlablenkvorrichtung 14 reflektierte undgescannte Lichtstrahl trifft auf das Bauteil 9, wo er inzwei Teilstrahlen 15, 16 aufgeteilt wird. Dasdie beiden Teilstrahlen durchlaufende Beleuchtungslicht wird an denSpiegeln 17, 18 reflektiert und über dieMikroskopobjektive 19, 20 von beiden Seiten ausin den gleichen Objektpunkt des Objekts 1 fokussiert. DasAblenken des Beleuchtungslichtstrahls 10 von der Strahlablenkvorrichtung 14 bewirkteine Ortsänderungder Beleuchtungsfokusse der beiden Mikroskopobjektive 19, 20,so dass das Objekt 1 zweidimensional in der Fokalebenebeleuchtet werden kann.
    [0027] Dasvon dem lediglich schematisch gezeichneten Objekt 1 ausgehendeDetektionslicht – beispielsweiseFluoreszenz-, Reflexions- oder Transmissionslicht – wird vonden beiden Mikroskopobjektiven 19, 20 aufgesammeltund durchläuftdie Beleuchtungsstrahlengänge 7, 8 inumgekehrter Richtung. Das vom Mikroskopobjektiv 19 (20)aufgesammelte Detektionslicht wird vom Spiegel 17 (18)in Richtung des den Detektionsstrahlengang 5 vereinigendenBauteils 9 reflektiert. Das Detektionslicht wird beim Passierendes Bauteils 9 vereinigt und über die Strahlablenkvorrichtung 14,den dichroitischen Strahlteiler 13 in Richtung der Detektionslochblende 21 geleitet.Lediglich wenn Detektionslicht aus dem Beleuchtungsfokus der beidenMikroskopobjektive 19, 20 stammt, kann diesesDetektionslicht die Detektionslochblende 21 passieren,da die Detektionslochblende 21 gemäß dem konfokalen Prinzip ineiner zum Beleuchtungsfokus der beiden Mikroskopobjektive 19, 20 optischkorrespondierenden Ebene angeordnet ist. In gleicher Weise ist dieAnregungslochblende 12 in einer optisch korrespondierenden Ebenezu dem gemeinsamen Beleuchtungsfokus der beiden Mikroskopobjektive 19, 20 angeordnet.
    [0028] Zurexakten Ausrichtung der beiden Mikroskopobjektive 19, 20 derart,dass sich die Fokusse der beiden Mikroskopobjektive 19, 20 exaktin einem Punkt in der Fokusebene treffen, dient die in 1 lediglichschematisch angedeutete und mit dem Bezugszeichen 22 verseheneerfindungsgemäße Vorrichtung,die in 2 in größerem Detaildargestellt ist.
    [0029] 2 zeigtschematisch den konkreten Aufbau eines Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtungzur Justierung der beiden Mikroskopobjektive 19, 20 ineiner 4Pi-Anordnung eines konfokalen Scanmikroskops 1.Eine Kreuzblende 23, die im unteren rechten Teil von 2 vergrößert dargestelltist, wird erfindungsgemäß in denPupillen der Mikroskopobjektive 19, 20 abgebildet.Dazu wird das Beleuchtungslicht einer Infrarot-Laserlichtquelle 24 über eineLichtleitfaser 25 auf ein geeignetes Linsensystem 26 geführt, sodass die Kreuzblende 23 vollständig und gleichmäßig ausgeleuchtetwird. Die Kreuzblende 23 liegt auf der der Beleuchtungslichtquelle 24 zugewandtenSeite eines 50/50-Strahlteilerwürfels 27 (BSCPoI Ir). Übereine Abbildungslinse 28 wird das Beleuchtungslicht an demBauteil 9 in die 4Pi-Anordnung eingekoppelt, so dass inder Ebene 29 ein Zwischenbild der Kreuzblende 23 entstehtund diese in den Pupillen der Mikroskopobjektive 19, 20 abgebildetwird. Das aus der 4Pi-Anordnung wieder austretende Licht durchdringtden Strahlteilerwürfel 27 undwird übereine Linse 30 in eine zweidimensionale Fourier-Transformierte derKreuzblende 23 abgebildet. Aufgrund der oben beschriebenenStrahlführungergibt sich fürjedes der beiden Mikroskopobjektive 19, 20 eineigenes Fourier-Bild der Kreuzblende 23. Eine weitere Linse 31 dientzur Abbildung der Fourier-Transformierten auf eine CCD-Kamera 32.
    [0030] Dieoptischen Verhältnissein der Ebene 33 der Fourier-Transformierten sind im linkenunteren Teil von 2 im Detail dargestellt. Zuerkennen sind zwei gegeneinander verschobene Fourier-Bilder der Kreuzblende 23,wobei das mit Fxy1 bezeichnete Fourier-Bild aus der Abbildung derKreuzblende 23 in die Pupille des Mikroskopobjektivs 19 unddas mit Fxy2 bezeichnete Fourier-Bild entsprechend von Mikroskopobjektiv 20 resultiert.Die in 2 dargestellte Situation, in der die beiden imSinne eines Fadenkreuzes erscheinenden Fourier-Bilder gegeneinanderverschoben sind, deutet daraufhin, dass die beiden Mikroskopobjektive 19, 20 nichtexakt aufeinander justiert sind. Für eine erste Grobjustierungder beiden Mikroskopobjektive 19, 20 wird in einemersten Schritt die Kamera 32 zur Kontrollsichtung verwendet,indem der Anwender durch Verschieben des Objektivs 19 – Mikroskopobjektiv 20 istim vorliegenden Fall ortsfest ausgeführt – die beiden Fourier-Bilder Fxy1 und Fxy2zur Deckung bringt. Ist dieses Vorgehen vom Anwender abgeschlossenworden, so kann er füreine Feinjustierung in einem zweiten Schritt einen Automatisierungsprozessstarten, der im Folgenden beschrieben wird: In der Ebene 33 derFourier-Transformierten sind im Raum der höheren Ordnungen zwei Photodioden 34, 35 platziert.Wenn die Mikroskopobjektive 19, 20 ideal zueinanderausgerichtet sind, d.h. bei Superposition von Fxy1 und Fxy2, zeigenbeide Photodioden 34, 35 jeweils einen maximalenIntensitätswert.Iterativ kann das verfahrbare Objektiv 19, das über nichtgezeigte piezoelektrische Verstellelemente hochpräzise positioniertwerden kann, soweit in x- und in y-Richtung bewegt werden, bis sichein Maximalwert an den Photodioden 34, 35 einstellt.Um die Ver fahrrichtung zu erkennen, muss das Objektiv 19 entweder über denMaximalwert hinaus verfahren werden, oder aber das Objektiv 19 mussmit ausreichend großer Verfahrweitein beiden Richtungen verschoben werden, bis sich ein Maximalwerteinstellt. Der Maximalwert wird zusammen mit den dazugehörigen Positionsdatendes Objektivs 19 in einem nichtflüchtigen Speicher festgehalten.Treten im Verlaufe der Messung Dejustagen der Mikroskopobjektive 19, 20 auf, sowerden die gespeicherten Positionsdaten aus dem Speicher abgerufenund entsprechende korrigierende Steuerbefehle an die piezoelektrischenVerstellelemente ausgegeben. Dieser Vorgang kann zyklisch wiederholtwerden.
    [0031] Für die Justierungder Mikroskopobjektive 19, 20 entlang der Strahlachse,d.h. in z-Richtung, bestehtdie Möglichkeitdie Information aus einer scharfen Abbildung der Fourier-Bilderausnutzen, d.h. es wird das Summensignal der beiden Photodioden 34, 35 verwendet.Dabei nutzt man aus, dass die Fourier-Bilder mehr und mehr verschwimmen,je mehr sich die Objektive 19, 20 aus ihrer exaktjustierten z-Positionentfernen. Sind die Objektive 19, 20 in z-Richtungzu stark dejustiert, so verschwinden die Fourier-Bilder vollständig. Einmaximales Summensignal ergibt sich folglich bei exakter Justierungder beiden Objektive 19, 20. Um Richtung und Maximum desSummensignals zu erfassen, wird daher das Objektiv 19 einwenig in positive und negative z-Richtung verschoben. Ist das Maximumdes Summensignals gefunden, so wird die dazu gehörende z-Position des Objektivs 19 ebenfallsin einem Speicher abgelegt. Das Objektiv 19 wird sodannan die gespeicherte Position bewegt. Damit ist die Justage des Objektivs 19 inz-Richtung ebenfalls abgeschlossen. Auch dieser Vorgang kann zyklischwiederholt werden.
    [0032] Abschließend seiganz besonders darauf hingewiesen, dass das voranstehend erörterte Ausführungsbeispiellediglich zur Beschreibung der beanspruchten Lehre dienen, diesejedoch nicht auf das Ausführungsbeispieleinschränkt.
    权利要求:
    Claims (26)
    [1] Verfahren zur Justierung der beiden Objektive (19, 20)in einer 4Pi-Anordnungeines vorzugsweise konfokalen Scanmikroskops (1), wobeimindestens eines der Objektive (19, 20) relativzu dem anderen Objektiv (20, 19) bewegbar ist, dadurchgekennzeichnet, dass ein Referenzobjekt in den Pupillen derObjektive (19, 20) abgebildet wird, dass aus den Abbildungendes Referenzobjekts fürjedes Objektiv (19, 20) ein eigenes Fourier-Bilderzeugt wird und dass durch Bewegen zumindest eines der Objektive (19, 20)relativ zu dem anderen die beiden Fourier-Bilder des Referenzobjektszur Deckung gebracht werden.
    [2] Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,dass die Fourier-Bilder von einer Kamera, vorzugsweise einer CCD-Kamera(32), erfasst werden.
    [3] Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,dass das einander Überdeckender beiden Fourier-Bilder mittels der Kameraabbildungen der Fourier-Bilder kontrolliertwird.
    [4] Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,dass die Kameraabbildungen der Fourier-Bilder mittels Bildverarbeitungssoftwareanalysiert werden.
    [5] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet,dass das einander Überdeckender beiden Fourier-Bilder mittels in der Ebene der Fourier-Bilderplatzierter Photodioden (34, 35) überwachtwird.
    [6] Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,dass mindestens eines der Objektive (19) in einer zur Strahlachseder 4Pi-Anordnung orthogonalen Ebene – x, y-Richtung – so verschobenwird, dass sich an beiden Photodioden (34, 35)jeweils ein maximaler Intensitätswerteinstellt.
    [7] Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,dass die mit den jeweiligen maximalen Intensitätswerten der beiden Photodioden(34, 35) korrespondierende x, y-Positionierungder Objektive (19, 20) gespeichert wird.
    [8] Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet,dass mindestens eines der Objektive (19) in Richtung derStrahlachse der 4Pi-Anordnung – z-Richtung – so verschobenwird, dass das Summensignal der Photodioden (34, 35)einen maximalen Intensitätswerterreicht.
    [9] Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,dass die mit dem Maximum des Summensignals der beiden Photodioden(34, 35) korrespondierende z-Positionierung der Objektive (19, 20)gespeichert wird.
    [10] Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet,dass die Messung bei Abweichungen der Signalintensitäten derPhotodioden (34, 35) von den Maximalwerten automatischunterbrochen wird.
    [11] Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet,dass das Objektiv (19) bei Abweichungen der Signalintensitäten derPhotodioden (34, 35) von den Maximalwerten automatisch nachgeführt wird.
    [12] Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 11, dadurch gekennzeichnet,dass das Kontrollieren der Fourier-Bilder und ggf. das Nachführen desObjektivs (19) währendeiner Messung in regelmäßigen Abständen zyklischwiederholt wird.
    [13] Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet,dass die währendeiner Messung durchgeführtenBewegungen des Objektivs (19) protokolliert werden.
    [14] Vorrichtung zur Justierung der beiden Objektive(19, 20) in einer 4Pi-Anordnung eines vorzugsweisekonfokalen Scanmikroskops, wobei mindestens eines der Objektive(19, 20) relativ zu dem anderen Objektiv (20, 19)bewegbar ist, insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens nacheinem der Ansprüche1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass zur Abbildung eines Referenzobjektsin den Pupillen der Objektive (19, 20) eine Beleuchtungseinrichtungund optische Einkoppelmittel vorgesehen sind, dass aus den Abbildungendes Referenzobjekts fürjedes Objektiv (19, 20) ein eigenes Fourier-Bilderzeugbar ist und dass durch Be wegen zumindest eines der Objektive(19, 20) relativ zu dem anderen die beiden Fourier-Bilderdes Referenzobjekts zur Deckung bringbar sind.
    [15] Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,dass Referenzobjekt eine zweidimensionale Struktur aufweist.
    [16] Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet,dass Referenzobjekt als Kreuzblende (23) ausgeführt ist.
    [17] Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet,dass das Referenzobjekt außerhalbdes 4Pi-Anordnung bereitgestellt ist.
    [18] Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 17, gekennzeichnetdurch eine Infrarot-Laserlichtquelle (24) als Beleuchtungseinrichtung.
    [19] Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 18, gekennzeichnetdurch einen Strahlteilerwürfel (27)und eine Linse (28) als Einkoppelmittel.
    [20] Vorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet,dass das Referenzobjekt unmittelbar auf der der Beleuchtungseinrichtungzugewandten Seite des Strahlteilerwürfels (27) angeordnetist.
    [21] Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 20, gekennzeichnetdurch eine Linse (31) zur Abbildung der Fourier-Bilderauf eine Kamera, vorzugsweise auf eine CCD-Kamera (32).
    [22] Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 21, dadurch gekennzeichnet,dass in der Ebene (33) der Fourier-Bilder Photodioden (34, 35)angeordnet sind.
    [23] Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet,dass die Photodioden (34, 35) im Raum höherer Ordnungder Fourier-Bilder angeordnet sind.
    [24] Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet,dass zwei Photodioden (34, 35) entsprechend derzweidimensionalen Struktur des Referenzobjektes derart angeordnetsind, dass die eine Photodiode (34, 35) die vertikalen(x) Struktu ren und die andere Photodioden (35, 34)die horizontalen (y) Strukturen der Fourier-Bilder erfasst.
    [25] Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 24, dadurch gekennzeichnet,dass piezoelektrische Verstellelemente zur Bewegung des Objektivs(19) vorgesehen sind.
    [26] Vorrichtung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet,dass die piezoelektrischen Verstellelemente in Abhängigkeitder Signalintensitätender Photodioden (34, 35) und/oder in Abhängigkeitvon Auswertedaten der Bildverarbeitungssoftware ansteuerbar sind.
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    AT528669T|2011-10-15|
    US20070153366A1|2007-07-05|
    DE102004001441B4|2006-04-27|
    US7477448B2|2009-01-13|
    EP1702224A1|2006-09-20|
    WO2005069041A1|2005-07-28|
    JP4531061B2|2010-08-25|
    EP1702224B1|2011-10-12|
    JP2007519952A|2007-07-19|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    2005-10-13| OP8| Request for examination as to paragraph 44 patent law|
    2005-12-22| 8127| New person/name/address of the applicant|Owner name: LEICA MICROSYSTEMS CMS GMBH, 35578 WETZLAR, DE |
    2006-10-19| 8364| No opposition during term of opposition|
    2016-08-02| R119| Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee|
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    DE200410001441|DE102004001441B4|2004-01-08|2004-01-08|Verfahren und Vorrichtung zur Justierung der beiden Objektive in einer 4Pi-Anordnung|DE200410001441| DE102004001441B4|2004-01-08|2004-01-08|Verfahren und Vorrichtung zur Justierung der beiden Objektive in einer 4Pi-Anordnung|
    AT04802699T| AT528669T|2004-01-08|2004-11-10|Verfahren und vorrichtung zur justierung der beiden objektive in einer 4pi-anordnung|
    EP20040802699| EP1702224B1|2004-01-08|2004-11-10|Verfahren und vorrichtung zur justierung der beiden objektive in einer 4pi-anordnung|
    PCT/DE2004/002482| WO2005069041A1|2004-01-08|2004-11-10|Verfahren und vorrichtung zur justierung der beiden objektive in einer 4pi-anordnung|
    US10/597,069| US7477448B2|2004-01-08|2004-11-10|Device and method for adjusting two objective lenses in 4Pi-system|
    JP2006548086A| JP4531061B2|2004-01-08|2004-11-10|４Ｐｉシステムにおける２つの対物レンズの調整方法及び装置|
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